實驗1總DNA提取
生物總DNA的提取是分子生物學實驗的一個重要內容。由於不同的生物材料細胞壁的結構和組成不同，而細胞壁結構的破壞是提取總DNA的關鍵步驟。同時細胞內的物質也根據生物種類的不同而有差異，因此不同生物採用的提取方法也不同，一般要根據具體的情況來設計實驗方法。本實驗介紹採用CTAB法提取植物總DNA的技術。
[實驗目的]
學習和掌握學習CTAB法提取植物總DNA的基本原理和實驗技術。學習和掌握紫外光吸收法鑑定DNA的純度和濃度。
[實驗原理]
植物葉片經液氮研磨，可使細胞壁破裂，加入去污劑（如CTAB），可使核蛋白體解析，然後使蛋白和多糖雜質沉澱，DNA進入水相，再用酚、氯仿抽提純化。本實驗採用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB是一種非離子去污劑，能溶解膜蛋白與脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的處理下，結合65℃水浴使細胞裂解、蛋白質變性、DNA被釋放出來。CTAB與核酸形成複合物，此複合物在高鹽（>0.7mM）濃度下可溶，並穩定存在，但在低鹽濃度（0.1-0.5mMNaCl）下CTAB-核酸複合物就因溶解度降低而沉澱，而大部分的蛋白質及多糖等仍溶解於溶液中。經過氯仿/異戊醇(24:1)抽提去除蛋白質、多糖、色素等來純化DNA，最後經異丙醇或乙醇等沉澱劑將DNA沉澱分離出來。
由於核酸、蛋白質、多糖在特定的紫外波長都有特徵吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峯在260nm。純的DNA樣品A260/280≈1.8，純的RNA樣品A260/280≈2.0，並且1μg/mlDNA溶液A260=0.020。
[實驗器材]
1、高壓滅菌鍋2、冰箱3、恆温水浴鍋4、高速冷凍離心機5、紫外分光光度計6、剪刀7、陶瓷研缽和杵子8、磨口錐形瓶（50ml）9、滴管10、細玻棒11、小燒杯（50ml）12、離心管（50ml）13、植物材料
[實驗試劑]
1、3×CTABbuffer（pH8.0）
100mMTris
25mMEDTA
1.5MNaCl
3%CTAB
2%β-巰基乙醇
2、TE緩衝液（pH8.0）
10mmol/LTris·HCl
1mmol/LEDTA
3、氯仿-異戊醇混合液（24：1，V/V）
4、95％乙醇
5、液氮
[實驗步驟]
1、稱取2g新鮮的植物葉片，用蒸餾水沖洗葉面，濾紙吸乾水分。
2、將葉片剪成1cm長，置預冷的研缽中，倒入液氮，儘快研磨成粉末。
3、待液氮蒸發完後，加入15mL預熱（60℃）的CTAB提取緩衝液，轉入一磨口錐形瓶中，
置於65℃水浴保温0.5h，不時地輕輕搖動混勻。
4、加等體積的氯仿/異戊醇，蓋上瓶塞，温和搖動，使成乳狀液。
5、將錐形瓶中的液體倒入50ml離心管中，在4℃下8000rpm離心10min。
6、離心管中出現3層，用滴管小心地將上層清液吸入另一干淨的離心管中，棄去中間層的細胞碎片和變性蛋白以及下層的氯仿。（根據需要，上清液可用氯仿/異戊醇反覆提取多次。）
7、收集上層清液，並將其倒入小燒杯。沿燒杯壁慢慢加入2倍體積預冷的95％乙醇。邊加邊用細玻棒沿同一方向攪動，可看到纖維狀的沉澱（主要為DNA）迅速纏繞在玻棒上。
8、小心取下這些纖維狀沉澱，加1～2mL70%乙醇沖洗沉澱，輕搖幾分鐘，除去乙醇，即為DNA粗製品。
9、將粗製品溶於TE緩衝液。
10、在分光光度計上測定該溶液在260nm/280nm紫外光波長下的光密度值。
[注意事項]
1、液氮研磨時，小心操作，以免凍傷。
2、所有操作均需温和，避免劇烈震盪。
[思考題]
CTAB、EDTA、巰基乙醇的作用分別是什麼？
液氮研磨的原理是什麼？
實驗二質粒DNA的提取
質粒DNA是分子生物學實驗中廣泛應用的載體分子。質粒是細菌獨立於染色體外的遺傳物質，是環狀的雙鏈DNA分子。由於質粒比較小，並且能進行獨立的自我複製，常常被改造為克隆和表達的載體分子。
[實驗目的]
通過本實驗掌握鹼裂解法提取質粒的基本原理，掌握鹼裂解小量提取質粒的實驗技術。
[實驗原理]
鹼裂解法提取質粒是根據共價閉合環狀質粒DNA與線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離它們。在pH值介於12.0~12.5這個狹窄的範圍內，線性的DNA雙螺旋結構解開而被變性，儘管在這樣的條件下，共價閉合環狀質粒DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞，仍會緊密地結合在一起。當加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩衝液恢復pH至中性時，共價閉合環狀的質粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確，而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復性就不會那麼迅速
而準確，它們纏繞形成網狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA，蛋白質-SDS複合物等一起沉澱下來而被除去。
[實驗器材]
1、恆温培養箱
2、恆温搖牀
3、台式離心機
4、高壓滅菌鍋
5、Tip頭、Eppendorg管
6、含有目的質粒的菌株
[實驗試劑]
1、溶液I
50mmol/L葡萄糖
5mmol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl
10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）
2、溶液II
0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等體積混合
3、溶液III
5mol/L乙酸鉀60mL
冰乙酸11.5mL
水28.5mL
4、TE緩衝液
10mmol/LTris·HCl
1mmol/LEDTA(pH8.0)
5、70%乙醇（放-20℃冰箱中，用後即放回）
6、EcoRI及其緩衝液
7、HindIII及其緩衝液
[實驗步驟]
1、將含有目的質粒的菌株接種於LB液體培養基中，37℃振盪培養過夜。
2、取1ml培養物倒入Eppendorf管中，12000r/min離心30sec。
3、吸去培養液，使細胞沉澱儘可能乾燥。
4、將細菌沉澱懸浮於100μL冰預冷的溶液I中，劇烈振盪。
5、加200μL溶液II（新鮮配製），蓋緊管皿，快速顛倒5次，混勻內容物，將Eppendorf管放在冰上。
6、加入150μL溶液III（冰上預冷），蓋緊管口，顛倒數次使混勻，冰上放置5min。7、12000r/min，離心5min，將上清液轉至另一Eppendorf管中。
8、向上清液加入等體積的飽和酚，混勻。
9、12000r/min，離心5min，將上清液轉至另一Eppendorf管中。
10、向上清液加入2倍體積乙醇，混勻後，室温放置5~10min。12000r/min離心5min。倒去上清液，把Eppendorf管倒扣在吸水紙上，吸乾液體。
11、1ml70%乙醇洗滌質粒DNA沉澱，振盪並離心，倒去上清液，真空抽乾或空氣中乾燥。12、20μLTE緩衝液，使DNA完全溶解，-20℃保存。
[注意事項]
操作時，避免劇烈震盪。
[思考題]
1、實驗操作中，飽和酚的作用是什麼？
2、SDS和NaOH的'作用是什麼？
[參考文獻]
《精編分子生物學實驗指南》（第四版）
[美]FM奧斯伯，RE金斯頓等主編科學出版社2005
實驗三總RNA提取
【目的和要求】
1．掌握樣品中總RNA的提取的原理和方法。
2．熟悉RNA純度及濃度檢測方法。
3．瞭解RNA提取過程中的注意事項。
【實驗原理】
RNA是基因表達的中間產物，存在於細胞質與核中。對RNA進行操作在分子生物學中佔有重要地位。獲得高純度和完整的RNA是很多分子生物學實驗所必需的，如Northern雜交、cDNA合成及體外翻譯等實驗的成敗，在很大程度上取決於RNA的質量。由於細胞內的大部分RNA是以核蛋白複合體的形式存在，所以在提取RNA時要利用高濃度的蛋白質變性劑，迅速破壞細胞結構，使核蛋白與RNA分離，釋放出RNA。再通過酚、氯仿等有機溶劑處理、離心，使RNA與其他細胞組分分離，得到純化的總RNA。在提取的過程中要抑制內源和外源的RNase活性，保護RNA分子不被降解。因此提取必須在無RNase的環境中進行。可使用RNase抑制劑，如DEPC是RNase的強抑制劑，常用來抑制外源RNase活性。提取緩衝液中一般含SDS、酚、氯仿、胍鹽等蛋白質變性劑，也能抑制RNase活性，並有助於除去非核酸成分。
【教學內容】
1．總RNA提取的基本原理和常用方法介紹
2．進行動物組織或血液樣品總RNA提取。
3．對提取的RNA的進行純度和濃度檢測。
【實驗器材和試劑】
超淨工作台、高速冷凍離心機、電泳儀、紫外分光光度計、凝膠成像系統、振盪器、移液器、吸頭、Ep管、玻璃勻漿器、試管。
玻璃器皿洗淨後置180℃烘烤8h；不耐高温的器皿（如塑料製品）應用0.1%DEPC浸泡2h,70～80℃烘烤乾燥，120℃高壓20min，再70～80℃烘烤乾燥方可使用。
細胞裂解液：異硫氰酸胍4mol/L；檸檬酸鈉（pH7.0）25mmol/L；十二烷基肌氨酸鈉0.5%；β-巰基乙醇0.1mol/L（稱取檸檬酸鈉0.64g，十二烷基肌氨酸鈉0.415g，吸取β-巰基乙醇0.7ml，用無Rnase的蒸餾水溶解，定容至50ml。然後取以上配製的溶液(CBS液)33ml，異硫氰酸胍25g,混合，完全溶解後4℃保存備用）
TRIzolRNA抽提試劑、2mol醋酸鈉、0.1%DEPC、平衡酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）、氯仿、無水乙醇、異丙醇、75%乙醇（用RNase-free水配製）、RNase-free的水。
【實驗方法】
（一）異硫氰酸胍法（PLT）
1．取新鮮動物組織0.1～0.2g置於組織勻漿器中，加入預冷的細胞裂解液1ml,在冰浴
中迅速勻漿15～30s，以充分研碎組織。然後將細胞懸浮液吸入另一試管中。
2．加入2mol醋酸鈉（pH4.0）120μl，充分混勻。
3．加入1.2ml酚：氯仿：異戊醇，充分混勻搖振10s，冰浴15min。
4．將混合物轉移至1.5mlEp管中，4℃，離心10000r/min,20min.
5．移取上層水相至另一Ep管中，加入等體積的異丙醇，靜置-20℃，30min沉澱RNA.
6．4℃，離心12000r/min，15min.
7．棄上清液，加入70%乙醇400μl,洗滌RNA沉澱物；如果RNA沉澱物被懸浮，則4℃離心10000r/min，10min。
8．棄上清液，自然乾燥，但應避免沉澱完全乾燥，否則RNA難以溶解。
9．加入100μl無RNase水重懸RNA，或加1ml無水乙醇和1/10體積3mol醋酸鈉（pH4.0），-70℃保存。
（二）TrizolReagent/總RNA提取試劑
TRIzol是從細胞和組織中提取總RNA的即用型試劑，在樣品裂解或勻漿過程中，TRIzol能保持RNA完整性。加入氯仿後，溶液分為水相和有機相，RNA在水相中。取出水相，用異丙醇可沉澱回收RNA。下面介紹由上海美季生物技術有限公司總RNA提取試劑推薦的操作步驟：
1.勻漿處理（Homogenization）
（1）組織中提取總RNA
①植物組織：植物葉片直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100mg植物葉片加入1mlTRIzol。
②動物組織：按10-30mg組織加入1mlTRIzol，用電動勻漿器或者一次性研磨杵充分勻漿。
（2）培養細胞中提取總RNA
①貼壁細胞：無須胰酶消化，可直接用TRIzol進行裂解，每10平方釐米培養面積加1mlTRIzol。
②懸浮細胞：可直接離心收集、裂解，每1mlTRIzol可裂解5×106動物或酵母細胞，或107細菌細胞。
（3）血液中提取總RNA
直接取新鮮的血液，加入3倍體積紅細胞裂解液，混勻後室温放置10分鐘，10,000rpm離心1分鐘。徹底吸棄上清，收集白細胞沉澱。每100-200μl血液收集的白細胞沉澱加入1mlTRIzol。
2．分層（PhaseSeparation）
（1）樣品加入TRIzol後，室温放置5min，使樣品充分裂解。
注：如不進行下一步操作，樣品可放入-70℃長期保存。
